Микробные клетки несут на своей поверхности разнообразные антигены, среди которых имеются детерминанты, общие нескольким микроорганизмам или даже идентичные животным клеткам и уникальные, присущие только данному виду или варианту микроскопических существ. Токсигенные штаммы обычно содержат эти специфичные детерминанты и в экзопродуктах. Для успешного проведения иммунохи-мического анализа очень важно получить антисыворотку (то есть иммунную сыворотку) на максимально очищенные специфичные для вида или варианта антигены. Достигается это предварительной дезинтеграцией микробных структур, выделением и очисткой необходимых антигенных комплексов, а также путем специфической адсорбции антисыворотки, полученной на взвесь целых микробных клеток к их оболочкам или на раствор экзотоксина. Пользуются и разведением антисыворотки, чтобы избавиться от неспецифических реакций. Специфичную антисыворотку используют для иммунохимической идентификации антигенов в нативном виде или в виде конъюгатов с видимыми под обычным световым микроскопом ферментами, обнаруживаемыми под люминесцентным микроскопом флуорохромами или видимыми под электронным микроскопом контрастерами.
В ветеринарной практике приходится также анализировать растворимые антигены микроорганизмов. Иммунохимической идентификации обычно подвергают клостридии, эшерихии, стафилококки и некоторые другие продуценты экзотоксинов, а также органы и ткани животных, инфицированных сибиреязвенным микробом. Причем в первом случае экзотоксины накапливают обычно культивированием бактерий на специальных средах, во втором — преципитиноген экстрагируют изотоническим раствором хлорида натрия. В лабораториях чаще идентифицируют взвесь микробных клеток, то есть корпускулярный антиген.
Для обнаружения и идентификации растворимых антигенов применяют целый ряд методов, основанных на феномене преципитации. Наиболее популярной в ветеринарной практике является кольцевая реакция преципитации (РП), предложенная Асколи в 1902/. для обнаружения сибиреязвенного антигена в кожевенном сырье. Ставят ее в специальных узких пробирках и при появлении помутнения на границе между антисывороткой и антигеном можно идентифицировать гомологичный антисыворотке антиген в течение нескольких минут. Простота и доступность пробирочной РП обеспечили широкое применение ее в ветеринарно-санитарной экспертизе и криминалистике для определения видовой принадлежности мяса или идентификации крови.
При постановке РП с меченным радиоактивным йодом антигеном, не превышающим молекулярную массу альбумина (то есть не выпадающим в осадок при 50%-ном насыщении сульфатом аммония), можно установить общее количество, образовавшихся антител. Этой методикой Фарра экспериментаторы пользуются для определения антигенсвя-зывающёй способности антител.
На принципе преципитации основана также реакция нейтрализации, сущность которой сводится к предннкубации токсинов, ферментов или реже вирусов с гомологичными антисыворотками с последующим воздействием смеси ингредиентов на живую систему (организм, культуру тканей или клеток). В результате предварительного выдерживания смеси антител с растворимым антигеном в пробирке последний обезвреживается, что подтверждается реакцией живой системы. Реакцию впервые продемонстрировали Беринг и Китазато в 1890 г. на модели столбнячных токсина и антитоксина. В настоящее время ее используют для видовой и особенно внутривидовой идентификации токсигенных Cl. perfringens, Cl.botulinum и некоторых других микроорганизмов.
Применение реакции преципитации в жидкой среде не позволяет, однако, характеризовать гетерогенность антигенов, то есть количество и концентрацию антигенов в препарате. Данные сведения можно получить, если поставить РП в геле (чаще в агаровом) или реакцию диффузионной преципитации (РДП). Обладая разной скоростью передвижения, различные антигены препарата неодинаково диффундируют, образуя в толще прозрачного геля на месте встречи с гомологичным антителом преципитаты Локализация и конфигурация линий преципитатов будут характерны для каждого компонента антигенного препарата, что служит критерием оценки его качества. Путем разведения препарата можно характеризовать относительное содержание в нем антигенов.
Если в среде геля диффундирует один реагент (обычно антиген), реакцию называют простой или одномерной диффузии, а если навстречу друг другу одновременно диффундируют оба реагента (антиген и антитело), ее называют реакцией двумерной или двойной диффузии.
Реакцию одномерной диффузии можно поставить в пробирке и на стеклянной пластинке. Пробирочный вариант РДП был впервые разработан в 1946 г. Оудином. На дно узкой пробирки помещали антисыворотку, смешанную с агаровым гелем и сверху заливали раствором антигена, покрытым слоем вазелинового масла. Антиген диффундировал в подлежащий слой геля и, вступая в реакцию с антителами, образовывал в нем линии преципитации. По их количеству и локализации судили о качестве антигенного препарата.
Манчини в 1965 г. предложил пластинчатый вариант одномерной РДП, который получил название реакции радиальной имму-нодиффузии (РИД) из-за того, что антиген диффундирует из лунок радиально в гель, смешанный с антисывороткой, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации. Диаметр этих колец прямо пропорционален концентрации антигена. На этом основании РИД используют для определения содержания растворимых антигенов (иммуноглобулинов всех классов, токсинов, ферментов, антигенных гормонов).
Но еще в 1948 г. Оухтерлони разработал метод двойной и м-мунодиффузии в агаровый гель. Для этого в пластинке агара вырезалось несколько лунок — центральная и периферические. В центральную лунку помещали антисыворотку, в периферические — растворы различных антигенов или раствор одного антигена в разных разведениях. Диффундирующие реагенты взаимодействуют, образуя линии преципитации в промежутке геля между центральной и периферическими лунками. Таким образом устанавливают количество антигенов в препарате, примерную их концентрацию и степень родства. В последнем случае обращают внимание на совпадение локализации и конфигурации линий преципитации сравниваемых антигенов (реакция идентичности), пересечение этих линий (реакция неидентичности) и наличие шпор у скрещивающихся линий преципитации. Реакция идентичности свидетельствует о тождественности сравниваемых антигенов, неидентичности— об их различиях, а наличие шпор — о содержании в сравниваемых разных препаратах общих антигенных детерминант.
Данная реакция является самым распространенным методом тестирования антигенных свойств растворимых препаратов в экспериментальной работе и широко внедряется в практику диагностических лабораторий из-за своей простоты и высокой чувствительности.
В 1953 г. Оакли и Фултроп предложили более четко воспроизводимый вариант метода Оудина. Он заключается в том, что в стандартные пробирки оба реагента помещают в смеси с агаром и встреча их происходит в пограничном слое геля такой же концентрации. По чувствительности он превосходит метод Оухтерлони.
В 1953 г. Грабар и Вильяме предложили комбинированный метод анализа растворимых антигенов, включающий в себя электрофорез антигена (центральная лунка) в агаровом геле с последующим взаимодействием его с антисывороткой (в боковых канавках) по типу реакции Оухтерлони. Этот метод называется иммуноэлектрофорезсм (ИЭФ) и позволяет более четко разделят^, антигены в испытуемом препарате, то есть более полно характеризовать набор антигенов в препарате. Однако для постановки ИЭФ требуется довольно высокая концентрация реагентов, особенно антигенов (табл. 5).
ИЭФ можно ставить с меченными радиоактивными веществами реагентами, тогда получится радиоиммуноэлектрофорез. С помощью фотоэмульсии он позволяет выявлять самые незначительные количества иммунных глобулинов.
5. Минимальное количество препаратов растворимых антигенов Е. coli 078: К-80, необходимое для образования видимого преципитата при взаимодействии с препаратом IgG крупного рогатого скота (мг/мл)
| Тест | Конечная концентрация IgG (мг/мл) | Потребность гексоз |
2. Серологическая реакция
