Градуировочная (калибровочная) кривая отражает тесную зависимость между абсорбцией (А), называемой также оптической плотностью — D или экстинкцией — Е (либо, в отдельных случаях, интенсивностью излучения света: в процессе осуществления пламенной фотометрии, флюориметрии), и концентрацией (С) вещества в сериях стандартных растворов.
К построению калибровочной кривой можно приступить лишь после того, как будет достигнута уверенность в том, что метод лабораторного исследования достаточно хорошо отработан. В противном случае точность расчета по калибровочной кривой оказывается неудовлетворительной из-за неадекватности условий и техники обработки стандартных и опытных проб.
При построении градуировочного графика следует стремиться к тому, чтобы калибровочные растворы помимо стандартного вещества содержали если не все, то основные (сказывающиеся на течении реакции) компоненты биологической жидкости. Это достигается применением стандартных сывороток — водных растворов, содержащих и другие, способные интерферировать с определяемыми веществами ингредиенты плазмы: в количестве, примерно соответствующем таковому в исследуемой биологической жидкости. Так, например, при определении содержания билирубина в плазме (сыворотке) крови стандартные растворы должны содержать белок (альбумин), поскольку он не только предохраняет билирубин от окисления, но и усиливает интенсивность окраски получаемых в процессе реакции азопигментов. При определении концентрации ионов калия в плазме крови стандартные его растворы должны заключать в себе также ионы натрия и кальция (в концентрации, соответствующей содержанию этих ионов в анализируемой биологической жидкости), так как они влияют на интенсивность свечения ионов калия в пламени газовой горелки пламенного фотометра.
Стандартные растворы должны готовиться с особой тщательностью — из навески, полученной на весах для очень точного взвешивания (аналитических и других). При этом следует обратить внимание на то, чтобы стандартные вещества строго отвечали своей химической формуле, имели высокую степень чистоты и достаточную стабильность, не были гигроскопичны и не взаимодействовали с газами воздуха. Навеска должна быть достаточно большой — для уменьшения технической ошибки взвешивания. Этому способствует взвешивание стандартного вещества не в обычно тяжелом (массивном) бюксе, а на листочке целлофана (либо полиэтиленовой пленки) с последующим количественно полным перенесением вещества в соответствующую стеклянную мерную посуду. Как правило, перед взвешиванием оно должно быть высушено до постоянной массы в сушильном шкафу при 110°С.
Используемую для получения стандартных растворов градуировочную мерную посуду нужно предварительно тщательно обезжирить и вымыть. Не рекомендуется сушить мерную посуду (в частности, мерные колбы) в сушильном шкафу, так как при высокой температуре меняется ее объем и нарушается градуировка.
Построение калибровочной кривой начинается с приготовления арифметического ряда разведении с последующей обработкой стандартных растворов аналогично опытным пробам. В отдельных случаях стандартные вещества можно использовать на конечном этапе исследования, например, путем их нанесения на электрофореграмму (либо хроматограмму), что несколько усложняет расчет результатов и привносит погрешность за счет неучтенных потерь анализируемого вещества в процессе его выделения (экстракции и других процедур).
Разведения стандартного вещества должны охватывать диапазон физиологических концентраций и выходить за пределы их минимальных и максимальных величин (до значений, могущих иметь место при встречающихся формах патологии). Так, например, при исследовании содержания общего белка в сыворотке (плазме) крови концентрация стандартного вещества (альбумина) должна быть в интервале от 40 до 120 г/л (при физиологической концентрации общего белка 65—85 г/л).
В большинстве случаев ряд калибровочных растворов получают путем разбавления основного, маточного раствора (как это имеет место, например, при определении содержания общего белка плазмы или сыворотки крови). Известно, что, чем концентрированнее раствор стандартного вещества, тем оно дольше сохраняется в нем. Многие низкомолекулярные соединения (гистамин, серотонин) допускают возможность хранения их растворов в замороженном состоянии. После оттаивания из основного раствора стандарта нередко делают промежуточные разбавления (одно или несколько), например, как это описано в разделе, посвященном исследованию содержания гистамина в плазме крови.
Для каждой рабочей концентрации стандартного вещества нужно сделать 3-5 отометрических или других (например, денситометрических) определений. Всего через методику проводят 2—3 серии окрашенных растворов, в результате чего обычно выполняется 6-12 исследований каждого рабочего разведения стандарта.
Суть построения градуировочной (калибровочной) кривой сводится к тому, что определенные объемы растворов серии стандартных проб обрабатываются в условиях, полностью идентичных таковым при анализировании исследуемого материала (опытных проб).
Набор построения калибровочной кривой для определения концентрации глюкозы
