Днк в клетки

По окончании смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором посредством ДНК-лигазы образованные реком-бинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и повышения количества копий. самый популярным методом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором помогает плазмида, есть изменение Е. coli. С целью этого бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием либо рубидием (ионами) чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомби-нантной ДНК.

Дабы повысить частоту проникновения ДНК в клетки, применяют способ электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка формирует полости в мембранах клеток, что содействует лучшему восприятию клетками ДНК- По окончании введения рекомбинантных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота изменения есть низкой. В большинстве случаев один трансформант появляется на 106 высеянных клеток. В случае если же вектор есть фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий либо дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию реализовывают ДНК в присутствии веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Вероятны кроме этого прямые микроинъекции ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

Днк в клетки

Наиболее значимым моментом, связанным с молекулярным клониро-ванием, есть поиск метода, разрешающего установить, вправду ли клонируемый фрагмент включился в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. В случае если речь заходит о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. К примеру, в плазмидном векторе pBR322, детерминирующем резистентность к тетрациклину и ампициллину, единственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I —плавление на этом сайте генерирует липкие финиши, разрешающие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Но наряду с этим плазмидный (векторный) ген ампициллинрезис-тентности инактивируется, в то время как ген тетрациклинрезистентнос-ти на векторе остается интактным. Как раз, ген тетрациклинрезис-тентности и употребляется для селекции клеток, трансформируемых рекомбинантными молекулами ДНК. Дабы убедиться, что клетки выросших колоний на среде с тетрациклином вправду содержат рекомбинантные молекулы ДНК, их контролируют посредством так именуемого «спот-теста» на паре чашек с плотной средой, одна их которых содержит ам-пициллин, в то время как вторая лишена этого антибиотика. Клонируемые ДНК находятся только в трансформантах, резистентных к тетрациклину (рис. 228). Что касается трансформантов, резистентных в один момент к тетрациклину и ампициллину (АрТс), то они содержат плазмидные (векторные) молекулы, каковые спонтанно купили кольцевую форму без включения в них чужеродной (клонируемой) ДНК. Второй метод обнаружения инсерции чужеродных (клонируемых) фрагментов в плазмидный вектор основан на применении вектора, содержащего ген (3-га-лактозидазы. Инсерция чужеродной ДНК в данный ген неизбежно инак-тивирует синтез р-галактозидаза, что возможно найдено посевом трансформированных клеток на среду, которая содержит субстраты р-галактозидазы. Эта среда разрешает селекцию окрашенных колоний клеток.

Как уже отмечено, рестрикционные линейные фрагменты векторной ДНК способны к восстановлению кольцевой структуры без включения в них клонируемых сегментов. Дабы уменьшить частоту спонтанного образования таких кольцевых молекул векторной ДНК, рестрикты векторной ДНК обрабатывают фосфатазой. В следствии этого образование кольцевых молекул ДНК делается неосуществимым, потому, что будут отсутствовать финиши 5′-РО^, нужные для действия лигазы.

Совокупность колоций-трансформантов, выросших на селективной среде, является совокупностью клеток, содержащих клоны различных фрагментов (генов) клонируемой геномной либо кДНК. Коллекции этих клонов формируют так именуемые библиотеки ДНК, обширно применяемые в генно-инженерных работах.

Последней стадией клонирования генов есть исследование и выделение клонированной ДНК, включая секвениро-вание.

Перспективные штаммы бактерий либо соматических клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, каковые осуществляют контроль синтез интересующих белков, имеющих коммерческую сокровище, передают в индустрию.

Тайна ДНК — документальный фильм

Похожие статьи:

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!:

Adblock
detector